普通pcr引物设计网站 pcr为什么要两种引物

PCR引物设计时有哪些注意事项?

引物设计参数:a引物长度一般在20bp左右,上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。b引物退火温度一般在58度,不同软件TM使用不同的算法,primer3,primer5,primer6,primerexpress等一般可以设置在55-58度,beacondesign可以设置在65左右。cGC含量一般没什么特殊要求,40-60最好,如果不好设计,30-80也是可以的。d产物长度在100-150,80-200也可以,不要在50bp左右,那样和引物二聚体不易区分,超过200bp可能会影响PCR扩增效率。e软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配,特别是3`端不能有碱基匹配,那样更容易形成二聚体。f引物设计好以后,在NCBI上做一个primer-blast,检测一下是否有非特异性扩增。