有哪些引物设计网站 pcr引物设计详细步骤

做RT-PCR设计引物时,找引物序列有哪些好方法?

引物可以通过一些软件设计,比如primer 5 ,但是还需要注意一些细节问题。比如1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。 GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G C) 2(A T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

怎样根据mRNA设计引物?

mRNA序列和cDNA序列基本一致,只是T、U的对应。引物设计是根据cDNA的两端序列,上游引物与cDNA的5‘端相同,下游引物与cDNA的3’反向互补序列相同,即与cDNA的互补序列的5‘端相同。cDNA的序列你在pubmed的网站可以找到(CDs那一项)。具体几个碱基,一般是15~18个就差不多了,尽量保证上下游引物的GC含量一致。这样PCR的时候,引物结合的效率是一致的,PCR成功的几率更高。另外,如果要做克隆质粒的实验,当然需要加入酶切序列啦!酶切位点的选择也有几点要注意的,你需要的话我再详细说啊!

如何进行引物设计?

如果这一对通用引物没有信号,说明你这个菌在这两个位置有snp,导致扩增不出来。几个方法可以参考一下。

1:你们大概知道这个菌的种属,那么就去ncbi上找近缘物种的16s序列,做序列比对,设计简并引物,扩增出全长,测序。

2:你们完全不知道种属,上网多找几对通用引物,最好是扩增V3V4区或者V4区的,扩增出部分再去测序比对,一般能确认属,再按照1的方法做。

3:在方法2能扩增部分序列但是设计全长引物扩增失败的情况下,利用得到的部分序列做race。

4:前面全部失败,提取DNA做2代测序,直接测基因组(如果觉得成本太高,可以少测点数据量,够比较就可以了)。